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烟叶与卷烟中生物碱组成及其迁移规律研究硕士论文pdf

时间:2017-04-27 23:00  来源:未知  作者:admin

  中国烟草总公司郑州烟草研究院 硕士学位论文 烟叶与卷烟中生物碱组成及其迁移规律研究 姓名:苏明亮 申请学位级别:硕士 专业:食品科学 指导教师:谢剑平;吴鸣 20040601 摘 要 本研究采用溶剂超声提取烟草生物碱的方法,和GC―NPD分析技术系统分析 了国内外不同类型、品种和产地的40个烟草样品和21种卷烟 含添加烟碱 烟 丝、烟气和滤嘴样品中的生物碱。采用双内标法对烟叶、卷烟烟丝、主流烟气和 滤嘴中烟碱、降烟碱、假木贼碱、新烟碱、麦斯明和可替宁的含量进行了准确测 定。研究比较了国内外不同类型、品种和产地烟草中生物碱含量的差异,以及卷 烟生物碱由烟丝向烟气迁移变化的规律和生物碱滤嘴截留效率,研究结果表明: ①采用优化的前处理方法 1ml 5%氢氧化钠和lOml三氯甲烷,超声提取150mg 烟末样品15分钟 得到了较好的重复性和回收率,相对标准偏差为0.94%一5.74%, 回收率为99.31%一102.83%。②国内不种品种和不同产地烤烟烟叶生物碱含量差 异较大,烤烟烟碱含量范围为0.79%一3.92%,烟碱占总生物碱比例范围为 76.92%一91.05%;烤烟中基本上不含麦斯明。烟碱、降烟碱和假木贼碱含量符合 上部 中部 下部的规律,新烟碱符合中部 下部 上部的规律。③国内不同类型烟 叶中烟碱、麦斯明和可替宁含量呈白肋烟 马里兰烟 烤烟 香料烟趋势,降烟碱、 假木贼碱和新烟碱呈白肋烟 烤烟 马里兰烟 香料烟趋势;而烟碱占总生物碱比 例呈马里兰烟 烤烟 白肋烟一香料烟趋势。④国内外烤烟生物碱含量水平大致相 当,而国外自肋烟以及香料烟生物碱含量则明显低于国内水平。⑤由部分卷烟烟 丝中不含麦斯明和可替宁,而所有卷烟烟气中均可检测到麦斯明和可替宁,提示 了烟气中部分麦斯明和可替宁来源于烟丝烟碱,初步建立了烟丝烟碱、麦斯明和 可替宁含量与烟气麦斯明和可替宁含量之间的模拟方程,麦斯明和可替宁的计算 复合滤嘴和外加烟碱卷烟除外 。⑥滤嘴中除了降烟碱含量低于检测5艮外,滤嘴 对卷烟烟气中其它生物碱均有截留。 本方法适用于同时测定6种烟草生物碱,得到的有关烟草生物碱含量数据以 及生物碱迁移行为的规律可应用于卷烟产品设计。 关键词:烟叶,卷烟,生物碱,组成,迁移行为,气相色谱,分析 Abstract Inthis of alkaloids domesticand tobaccoas as study,the foreign wellcigarette smokewere ultrasonicand GC NPD. separatedby shakinganalyzedby with equipped Thealkaloidssuchas and cotinine,were determinedtwo―internal―standardmethod.The quantitatively by and amount of of40 alkaloidstobacco fromdifferent composition samples types. and varietieswere the data in regions ofthealkaloids quantitative compared.Using cut smokeandfilter tobacco,mainstreamof transfer brands,the twenty―onecigarette from cuttobaccoto and efficiency mainstreamsmokeretentionoffilterwere calculated. Theresultsobtainedwereas alkaloidsbe follow:1 The could target acceptably with and tobaccolml5%NaOH separatedbyultrasonicallyshaking ground 150rag 10ml forlOmin.TheofRSDwas the ofthe CHCl3 O.94%一5.74%and range recovery methodswas 99.31%.102.83%.2 TheamountolkaloidsinFlue―curedfrom different andvarietieswere in regions different.Theofnicotine significantly range flue.curedtobacco of tototalalkaloidswas was0.79%一3.92%,andtherationicotine was in 76.92%一91.05%.Therefew mostollFlue―curedtobacco.The myosmine amountof and inFlue―curedshowedthe of anabasine nicotine,nomicotine tendency leaf cutterleaf lowertheamountonatabinewiththe upper leaf,but agreed of leaf.3 The and cutter leaf lower tendency leaf upper nicotine,myosmine cotininecontentindifferentofdomestictobaccoconformtothetrendof types Burley amountoftherestoftobaccoalkaloidswas Maryland Flue―cured Oriental.the ofnicotinetotaltobacco ratio to Burley Flue―cured Maryland Oriental,the of alkaloidswas alkaloids foreign no alkaloidsof anddomesticFlue・curedhad differentia,but significant foreignBurley than cotinine andOrientalwere lowerdomestic and obviously samples.5 Myosmine all smoke exist in ofcut mainstream cigarette onlypart cigarettesamples,but and a of and contained cotinine.It that myosmine suggests majoritymyosmine in nicotineincut simulated cotinine smoke from mainstream cigarette.Two originate in cotinine the between and equations,which relationshipmyosmine expressed 5of73 Page cotiniue iu smokeand mainstream andcotinineincut nicotine,myosmine cigarette, were for filter and lengthcigarette,charcoal developed Exceptspecial cigarette of in added amountnomicotinefilterwas than cigarettenicotine .6 The lower minimumdetectable retention ofotheralkaloidsinfilter limitation,but efficiency wele 25%. morethan generally The 6 methodestablishedis suitablein tobaccoalkaloids analysing about tobaccoalkaloidsandthetransfer data of compositions simultaneously,the be behavioroftobaccoalkaloidscombustionof couldusedinthe during cigarettes of designcigarette products, behaviorGC,analysis 6of73 Page 1引言 1.1烟草生物碱分析研究现状 烟草和卷烟烟气的化学组成十分复杂,至今从烟草和卷烟烟气中鉴定出的成 分已经超过5000种“3,而其中最主要的、也是烟草特有的物质就是烟草生物碱。 烟草中绝大部分生物碱是3一吡啶基衍生物,烟草生物碱含有两个氮杂环和一个 不对称碳原子,属弱二级碱,已经定名的烟草生物碱有40多种”1,其中主要的 烟草生物碱有:烟碱、降烟碱、麦斯明、假木贼碱、新烟碱和可替宁 图1 。 、/\ 厂1c 、\z.工 9黼 、,\№ @嗍碱 P~麦了斯 ≮明 嘏∽0 假木贼碱 新烟碱 可替宁 图1 6种主要烟草生物碱 1.1.1生物碱组成与含量对卷烟制品生理强度、烟气特征的影响 烟碱占烟草生物碱比率很高,卷烟燃吸时出烟碱,可使吸烟者的植物神 经和中枢神经系统感受到刺激兴奋作用”1,该刺激兴奋作用既可使吸烟者对烟碱 系统疾病的几率。 降烟碱对人体的神经刺激较烟碱弱,普遍认为”1降烟碱对烟气吸味有负面的 影响,特别是降烟碱与NNN显著正相关,极大影响卷烟制品的吸食安全性。但也 有报道”’认为降烟碱吸昧柔和,并且降烟碱的迁移率很低,降烟碱较烟碱可降低 卷烟烟气的刺激性,在一定程度上对烟气吸味有正面作用。此外,降烟碱可以阻 止人体内淀粉B一缩氨酸纤维的形成“3,而淀粉0一缩氨酸纤维很容易缩聚在一起 T.J.等”1认为降烟碱和葡萄糖可以 导致人体多种严重的神经性疾病,Dickerson 加成到淀粉且一缩氨酸纤维的一段链长40的氨基酸片断上,进而了淀粉B一 缩氨酸纤维自缩聚在一起,根据质谱数据Dickerson T.J.等认为降烟碱可以减 少18%淀粉D一缩氨酸纤维的自缩聚作用。 麦斯明则有一种老鼠气味。1,严重影响卷烟产品的吸味。假木贼碱的毒性稍 稍低于烟碱,Gersdorff w.A.“…使用鱼比较了烟碱和假木贼碱的量了 这一点.但目前还没有关于假木贼碱和新烟碱对烟草吸味以及人体神经系统作用 的报道。可替宁作为最终代谢产物,对人体影响甚微。 1.1.2生物碱组成与含量对卷烟制品吸食安全性的影响 烟草特有亚硝胺 TSNAs 可产生肿瘤,极大影响卷烟吸食安全性。TSNAs 主要有以下4种:亚硝基降烟碱 NNN ,亚硝基新烟草碱 NAT ,亚硝基假木贼碱 的致癌活性““,TSNAs是烟草中危害性很大的一类物质。 烟草生物碱作为烟草特有亚硝胺的前体之一,在烟草调制和卷烟燃吸过程中 易代谢为降生物碱,进而与亚硝酸盐形成有致癌性的烟草特有亚硝胺,因此烟草 中生物碱含量与组成与相应的烟草特有亚硝胺的含量与组成密切相关“” 图2 。 关于烟草生物碱和TSNAs关系的报道很多,结果也略有差异:BurtonH.R.等“21 认为烟草生物碱与TSNAs存在正相关关系,但不显著。DjordjevicM.V.“”认为 烟草生物碱与TSNAs存在极显著的正相关关系,其中,降烟碱与NNN的相关系数 达到了0.95。史等“”对我国不同类型的烟叶和卷烟生物碱含量和TSNAs水 平进行了对比研究,认为在一定亚硝酸下,TSNAs水平以及NNN水平基本上 由降烟碱含量决定,史认为应通过遗传改良解决烟碱向降烟碱问题,最 大限度去除型烟叶以降低降烟碱,最终达到降低TSNAs的目的。 n n 如 秒3一 秒2/ 假丰贼碱 p。碱l 斧黼J几一 \∥嘶 叭0阶 @J少 Cz吣 NAT NNK NNN 图2烟草生物碱与TSNAs关系 1.1.3卷烟抽吸前后生物碱迁移行为差异 不同生物碱在卷烟烟气中迁移行为差别很大,对烟草和卷烟烟气中生物碱的 迁移行为研究一直是国外烟草研究机构研究的热点和难点课题之一。国外对烟草 生物碱的迁移研究涉及范围很宽,既有采用Gc直接测定生物碱的迁移以及降解 行为”…,也有外加含“C烟碱示踪分析迁移行为m3,此外还有热重/差热/质谱m】 分析不同价态烟碱的迁移行为的细微差异等。 1.2生物碱的分离与分析 l_2.1烟碱和降烟碱的分离分析 烟草和烟气生物碱的分析一直受到烟草界的重视,但受到分离分析方法和条 件的,早期烟草和烟气生物碱分析多数只针对烟碱及降烟碱进行研究。早在 1909年,Bertrand G.““报道了烟碱的重量分析法。1943年BowenC.V.等“”采 用蒸馏提取法,使得烟碱和降烟碱的回收率达到了97.2%-101.8%,但是还不能 对其它生物碱进行分离。 1947年,Bowen C.V.等””1用正己烷作淋洗液,采用淀粉柱分离烟碱和降烟 碱,这很可能是色谱法在生物碱分离和分析中的最早应用,但这种方法对降烟碱 含量高的样品分析不是很令人满意。 F.G.”“比较了Bowen―Barthel方法“…、 1952年,Kentucky大学的Houston 滴定法和硅钨酸重量法对烟碱进行测定,认为三种方法的结果基本一致。1955 年,CundiffR.H.”2I采用苯一氯仿对烟样进行萃取,使用高氯酸进行滴定,烟碱 和降烟碱的回收率在97.2%一98.4%之间。滴定法成本低、操作简便、测定用时短. 但相对标准偏差较大,对测定含量较少的其它烟草生物碱没有实质意义。1955 年,LeisersonL.等…使用纸色谱分析了烟碱和其它生物碱。1958年,Laurene A.H.等”1使用分光光度法检测了烟气中的烟碱含量,结果与硅钨酸重量法的结果 吻合得很好。硅钨酸重量法和分光光度法在相当长的时间里被视为烟碱的标准分 析方法,尤其是分光光度法检测速度很快,对低含量的准确度很高,选择性也较 好。 1967年,HarveyW.R.等人”“使用蒸馏方法提取烟草中的生物碱,用甲醇一 盐酸作提取剂,同时使用活性炭除去干扰物质,用uv吸收检测进行定量。1967 年,Kossey0.F.””使用二维薄层色谱 thin―layer W.R.等“”又对蒸馏方 10种烟草生物碱,但未能给出定量结果。1969年,Harvey 法的提取溶剂进行了比较,发现使用甲醇、乙酸和水可以达到较好的萃取效果。 1.2.2 GC方法分析烟草生物碱 进入20世纪70年代,伴随色谱技术的发展,烟草生物碱的分析逐渐转入以 气相色谱分析为主。1976年,烟草公司的PilottiA.等…1使用GC-MS检测 了烟碱以及一系列烟碱的代谢产物,他们使用了氘代烟碱作内标,这是首次关于 ;c―Ms分析烟草生物碱的报道。 1977年Burns D.T.等…使用索氏萃取来提取烟草生物碱。索氏萃取法能提 取全部生物碱,一直到现在,索氏提取都被认为是有效的。但是索氏提取的缺点 是提取时间过长,通常不能少于2h。他们采用GC~FID分离和检测烟草生物碱, 并使用HP3370电子积分仪对保留时间和峰面积进行了较精确的计算。但他们不 能有效地分离麦斯明和新烟碱,也没有检测到假木贼碱。 1979年Rosa N.””使用KOH改性的Carbowax柱对烟草生物碱进行分离,基 本上成功地分离了烟碱和其它生物碱,这种KOH改性的Carbowax柱后来应用得 较为广泛。但是Carbowax柱不能很好地分离新植二烯、脂肪烃和烟碱,采用FID 进行检测势必会在色谱图烟碱峰附近出现较大的新植二烯峰,这不利于对烟碱的 准确定量,选择NPD作为检测器则可以避开这一问题。Carbowax对麦斯明和新 烟碱的分离效果不算很好,但可以通过碱性改性进行修饰,碱性特性可以色 谱柱对生物碱尤其是降烟碱的吸收,从而防止拖尾峰的形成。 1981年SeversonR.F.等。”使用快速玻璃毛细管GC―NPD定性定量地测定了 烟草中的烟碱、降烟碱、麦斯明、新烟碱、假木贼碱和2,3’一二联吡啶。Severson R.F.等最初使用超声波技术是为了提取烟草中的新植二烯和脂肪烃,结果提取效 果很好,于是他们把超声波振荡应用于烟草生物碱的提取:把含2,4’一二联吡 啶内标的甲醇一KOH溶液和烟样放入自动进样瓶中,在超声波浴中振荡提取 u 15min,然后取l l提取清液进Gc分析。8everson R.F.等对超声波振荡提取和 传统的索氏提取比较后认为:简单的超声波振荡提取与传统的索氏提取所得的结 果几乎一致,完全可以用超声波振荡提取代替索氏提取,可使提取时间从2h缩 短为15min,极大地提高了分析速度。此外,他们还发现:同时使用填充柱和NPD 时NPD响应曲线的线性较差:而同时使用毛细管Gc和NPD则可以得到较好的线 性响应,并且重现性也比较好。Severson R.F.的方法对以后提取分离烟草生物 碱方法的发展影响较大。 1988年,Burton H.R.等””1分析了采收和调制期间白肋烟中生物碱以及酰化 生物碱的含量,他们采用的方法与Severson R.F.等。”的方法完全相同,他们在 试验中发现:过熟烟叶中可替宁含量较高,成熟烟叶中新烟碱含量几乎是欠熟烟 叶中含量的百倍,这和Frankenburgw.G.等。”的结果一致。 1989年,AndersonR.A.等。…也采用类似SeversonR.F.的方法,他们采用 pH 4.5的含有微量抗坏血酸的柠檬酸盐一磷酸盐缓冲溶液做提取液,对烟样提 取后把pI 调至5.0,然后加入30ml乙酸乙酯进行萃取,经过相分离取部分乙酸 乙酯相加盐酸分离反萃取3次,得到的水相用NaOH调pH 5.0,在冰浴下用氯 仿萃取3次,氯仿萃取后加入无水硫酸钠然后密封,于5℃保存直至进气相分析。 1997年,刘百战“”使用大孔毛细管GC-FID测定了烟草中的生物碱,他使用 和5%的NaOH对烟样进行提取,烟碱的回收率可达97%以上。刘百战认为: ①烟碱和其它生物碱含量的差别很大,要求色谱柱容量大;②烟碱和其它生物碱 含量的结构相似,要求柱效强:⑨生物碱的极性大,要求色谱柱惰性好。因此他 采用了0.53mm内径的大孔毛细管柱来分离烟草生物碱,大孔毛细管柱结合了填 充柱和毛细管柱的优点,柱容量大且柱效高,分析一个样品4.5分钟即可完成。 实验结果表明该法可以快速准确地测量烟草生物碱。2001年,云南烟草研究院 的杨金辉等…’也使用GC―FID测定了烟样中的生物碱的含量,进一步说明该方法 的快速准确和可行的特点,值得推广。杨金辉等采用了三种溶剂:CH。C1。,CHCI。 以及CHCl。:苯 1:9 对烟样进行了提取,并比较了三种溶剂提取效率。从结 果看,CH。Cl。提取效率最高,但仅达到了82.37%,这可能与他们添加的碱过少致 使生物碱没有完全游离化有关。 2001年,史等。71分析了我国主要烟区烟叶中烟碱、降烟碱、假木贼碱和 新烟碱的含量,并着重分析了我国烟草生产中烟碱向降烟碱的问题,他们采 用甲基丁醚作提取溶剂,其方法与BurtonH.R.。21和Sevenson R.F.”“的方法类 似。 色谱柱是Gc分离的关键,而色谱柱固定相的极性则对烟草生物碱的分离效 果有较大的影响,最常使用的是碱改性过的聚L----醇非极性固定相。2000年 Lourenco M.D.G.等。”使用GC检测了烟草中的生物碱,他们使用了各种不同极性 的固定相对烟草生物碱进行了分析和对比,认为极性柱有以下两个缺点: 1 极 性柱对降烟碱的吸附能力过强; 2 烟草萃取物中其它物质对生物碱的定量干扰 严重。他们采用了一种新型的非极性色谱柱和经过碱改性的固定相来分离烟草中 的生物碱,并同时使用两种内标分别对烟碱和其它生物碱定量,使得定量更为精 确。由于新烟碱不能买到标样,他们近似认为其响应值与假木贼碱相似,由于新 烟碱和假木贼碱结构非常相似,这样的近似也是合理的。 2002年,菲莫公司的YangS.S.等l…使用CC―NPD分离检测了烟草中的生物 碱,他们使用氨水对生物碱进行游离化,并对前处理参数进行了很细致的优化, 他们考察了甲醇、丙酮、二氯甲烷、己烷以及混合溶剂对生物碱的提取效率,认 为:提取生物碱的关键是在溶剂的极性以及溶剂和氨水的互溶度之间找到一个平 衡的最佳点。最终他们选择的最优溶剂条件为甲醇:二氯甲烷 1:3,此外他们 还提高了进样口温度实现热聚焦,对进样衬管进行硅烷化减少吸附导致的峰展 宽,在进样衬管中填充了红硅藻土担载的2%KoH改性的10%Carbowax20M减少 过载并避免甲醇进入色谱柱。 最近几年,SPME 固相微萃取 技术也被应用于烟草生物碱的分析。1998 年,Yang 术首次应用于烟草生物碱的分析。SPME定性效果非常好,检测限甚至在ppb以 下。SPME的无溶剂进样技术使得它特别适合于与快速Gc对接,由于不用担心巨 大的溶剂峰影响,还可以采用气相无分流进样模式。 2002年,Wu w.J.等“”使用SPME-GC―MS测定了烟草中的生物碱的含量,他们 采用了氘代生物碱作内标,该法结合了SPME的高通量、最少溶剂使用、非接触 操作和毛细管Gc的高色谱解析能力以及质谱定性和高灵敏度的优点,但是该法 的定量效果一般。 SPME的优点很突出:高通量,无溶剂使用,无携带问题,易制样,灵敏度高, 定性能力很好。但8PME缺点也很明显:①烟草体系复杂,而SPME灵敏度极高, 普通内标化学性质与各生物碱差异较大,选用普通内标将使定量精度和准确度大 打折扣。 童 SPME纤维容易老化,重复性试验效果不好,致使定量效果不是很理 想,标准偏差较大。 1.2.3 l砰Lc方法分析烟草生物碱 HPLC 高效液相色谱 法较少应用于烟草生物碱分析。1980年,Plade J.J. 等““使用HPLC分离测定了烟草提取液中的4种生物碱。HPLC方法通常要求pH 范围为2-9,因为高pH会损害色谱柱上的硅粒,但是在低DH条件下,生物碱多 里双质子态导致保留时间很短,这一矛盾使得应用HPLC同时测定多种生物碱的 时候显得很困难,并且HPLC方法的灵敏度比Gc低,这使得HPLC分离烟草生物 碱的应用很少。 1981年Saunders 5.A.等“”使用HPLC对烟草生物碱进行了定量分析,色谱 柱使用反相c,a柱,为保持生物碱以游离态存在并避免高pH对柱的损伤,他们把 个样品需要2天以上,耗时太长,并且前处理过程极其繁琐。 1.2.4 CZE方法分析烟草生物碱 最近几年,CZE 毛细管区域电泳色谱 作为高效的分离分析手段,也被应 用于烟草生物碱的分析。1995年,YangS.S.“”使用磷酸盐缓冲溶液,用uV做 检测器,对烟草中的部分生物碱含量进行了分析。CZE分析速度快,lmin即可完 成一个样品的分析。CZE可以在较宽的pH范围内操作,可通过调节pH来控制生 物碱的3种形态,低pH可使生物碱处于双质子态,有利于CZE分析。1996年, YangS.S.“”进一步改进了处理过程,使得CZE可以同时测定结构相似的生物碱。 2001年,Lochmann H.等““使用较高浓度的柠檬酸盐缓冲溶液,使得pH更低, 这样不仅得到了更高的分离效率,同时还降低了检测限。LochmannH.甚至实现 了分析单个烟草细胞中局部组织的烟碱含量,这给CZE分析整株烟草的烟碱浓度 的空间分布带来了可能。Lochmann H.在分析了单个细胞的烟碱含量以后,发现 细胞膜巾的烟碱含量显著地高于细胞质中的烟碱含量。细胞膜是烟叶组织于 大气中的第一道屏障,含有高浓度的烟碱以抵御害虫的也是合理的。 CZE作为新兴的分离分析方法具有很独特的优点:样品消耗极少、高效、高 分辨率、分析时间短、选择性好、与其它分析方法互补性较好,如果缓冲溶液 pH足够低的话,样品保存数天也没有明显损失,不会降低回收率。需要特别指 出的是CZE要求进样量极少,只用纳升级样品,这给分析单个烟草细胞中生物碱 含量带来了希望。但CZE方法也有其缺点:①仪器很昂贵;②uv检测器对某些 生物碱的灵敏度较低。使用CZE分析生物碱的两个关键因素是:生物碱的离子化 和电渗流。这两点取决于缓冲溶液的pH和离子强度,pH越低以及离子强度越高, 生物碱质子化程度则越充分,电渗流则越慢,色谱峰形状和uv吸收则越好“4”1。 1.3生物碱由卷烟烟丝向烟气的迁移行为研究 Janeiro 国外对生物碱迁移率的研究开展较早,1983年, R.”…在英美烟草 公司的一次研讨会上提出:“为了使吸食者更满意,应不断改进产品,这要求烟 草制造商应尽可能了解和把握烟碱,也就是找出影响烟碱从烟丝向烟气迁移的因 素,以及找出影响烟碱在烟气中由粒相向气相传递的速率。”事实上,只要测得 同一批卷烟烟丝的生物碱含量和卷烟抽吸后烟气中的生物碱含量即可求得生物 碱的迁移率:生物碱转移率 羹蠹器量睾瓣×・。。% 踪研究,结果表明:①烟草中固有的生物碱和外加的生物碱表现出的迁移性质较 为相似:②生物碱只存在于粒相物中,分析剑桥滤片截流的粒相物而不用考虑气 相,即可得到准确的烟气生物碱含量。 1999年StevensN.A.等“”使用GC―AED在卷烟中添加了氘代烟碱,对氘代烟 碱在卷烟抽吸过程中的变化历程进行了,结果发现79%的氘代烟碱可以进入 到主流烟气和侧流烟气中。 1999年SeemanJ.I.等“71使用TG/DTA/MS 热重分析/差热分析/质谱 分析 了烟碱和烟碱盐向气相中的热迁移,他们认为烟碱的热迁移有三种机理: 1 烟碱盐的脱质子化: 淤I滞l嘏 2 烟碱盐中羧酸阴离子基团分解: 3 单质子态烟碱盐的岐化反应: :嚣亭一毋?+滞训 2000年Perfetti T.A.等”1使用Gc―Ms对不同烟碱盐迁移为主流烟气中烟碱 的行为进行了对比分析。在实验中,他们共添加了7种烟碱盐 水杨酸烟碱盐、 酒石酸烟碱盐、藻酸烟碱盐、单宁酸烟碱盐、半乳糖醛酸烟碱盐、醋酸烟碱盐和 二苯甲酰酒石酸烟碱盐 ,他们发现:烟碱盐的热稳定性对主流烟气中的烟碱外 消旋化没有任何贡献,也就是说烟碱盐与主流烟气中新产生的d-nicotine无关。 烧温度下,不必考虑各种烟碱盐热稳定性的差异,因此各种烟碱盐向烟气中输送 烟碱的效率很相似。 2001年Perfetti 烟丝到主流烟气的迁移行为,结果显示:烟碱的迁移率与烟草的类型和种类有关, 截至目前,还没有有关烟碱外其它生物碱迁移率的报道,也没有生物碱之间 相互“变形迁移”的报道。随着烟叶生产技术和烟叶内在质量的不断提高、卷烟 加工工艺和生产装备不断的改进,以及新型滤嘴以及通风稀释等技术被采用,卷 烟产品焦油量和烟气烟碱含量也在逐年降低,当今卷烟产品的生物碱迁移规律与 以往的报到相比肯定有较大的差异。 综上所述,目前烟草生物碱分析主要有3种方法:气相色谱法”““,高效液 相色谱法:”’4”和毛细管区域电泳法。“”。其中,高效液相色谱法灵敏度较低,对 流动相pH要求严格,现在已很少采用:毛细管区域电泳法分辨率高,分析时间 短,并且样品消耗极少,可对单个烟草细胞进行生物碱含量分折,但其仪器昂贵, 相应的紫外检测器对某些生物碱的灵敏度较低,目前采用的很少;而气相色谱法 前处理简单,可方便使用NPD检测含N的烟草生物碱,应用相对广泛。 总之,烟草生物碱的组成以及在卷烟燃吸过程中的迁移行为对卷烟产品的生 理强度、品质风格及其吸食安全性都有很大的影响,而多项研究结果的差异也反 映出各种烟草生物碱及其衍生反应物测定方法的差异。因此,系统准确地研究国 内外各类型烟草、卷烟中生物碱组成与含量以及迁移行为,统一建立简捷的测定 方法,对于提高卷烟产品的设计水平和准确评价卷烟吸食安全性常有意义 的。 本研究拟采用GC―NPD测定国内外40种烟叶中的6种生物碱,对溶剂超声提 取前处理参数进行优化,并建立溶剂提取前处理和GC-NPD分析烟草生物碱的方 法,对国内外不同类型、品种以及产地烟叶中的生物碱组成和含量进行全面分析, 进而提供较全面的我国主要类型烟叶中生物碱含量数据,并对国内外主要类型烟 叶中的生物碱含量进行对比。同时,选取部分国内外代表性卷烟品牌,分析其卷 烟烟丝、主流烟气和抽吸后滤嘴中生物碱组成和含量,对生物碱的迁移行为进行 探讨,试图找出部分生物碱的迁移变化规律,以利于在卷烟产品设计中较准确地 控制生物碱及其反应衍生物的量。 2实验 2.1样品、标样、试剂和仪器 2.1.1实验样品 2.1.1.1烟叶样品 国内烟叶样品如表1所示,收集了24个烤烟样品、4个白肋烟样品、2个香 料烟样品和1个马里兰烟样品,总计31个烟样。 袭1国内烟叶样品 国内烟叶类型 样品产地 品种 等级 年份 4 烤烟 福建龙岩长汀 K326 B2F 2003 福建龙岩长汀 K326 C3P 2003 福建龙岩长汀 K326 X2F 2003 云南大理弥渡 K326 B2F 2003 云南大理弥渡 K326 C3F 2003 云南大理弥渡 K326 X2F 2003 河南平顶山郏县 NC89 B2F 2003 河南平顶山郏县 NC89 C3F 2003 河南平项山郏县 NC89 X2F 2003 山东临朐 NC89 B2F 2003 山东临朐 NC89 C3F 2003 山东临胸 Nc99 X2F 2003 山东临朐 中烟100 B2F 2003 山东l临朐 中烟100 C3F 2003 山东临朐 中烟100 X2F 2003 河南平顶山郏县 中烟100 B2F 2003 河南平顶山郏县 中烟100 C3F 2003 河南平项山邦县 中烟100 X2F 2003 云南楚雄烟科所 云烟85 B2F 2003 云南楚雄烟科所 云烟85 C3F 2003 云南楚雄烟科所 云烟85 X2F 2003 贵州遵义绥阳 云烟85 B2F 2003 贵州遵义绥阳 云烟85 C3F 2003 贵州遵义绥阳 云烟85 X2F 2003 白肋烟 湖北恩旖 鄂烟1号 上二 2003 湖北恩施 鄂烟1号 中三 2003 云南宾川 TN86 上二 2003 云南宾川 TN86 中三 2003 17of73 Page 香料烟 湖北 杰里克 上一 2003 云南保山 BASWA AB级 2003 马里兰烟 湖北宜昌五峰 2003 国外烟叶样品如表2所示,烤烟选择了津巴布韦和巴西产地;白肋烟选择了 巴西和马拉维产地,香料烟选择了土耳其AG。样品采集年份分别为1998年和2003 年。 表2国外烟叶样品 产地 类型 商品名 年份 - 一 蓦撇舢li㈣㈣㈣㈣竖 2.1.1.2卷烟样品 选取有较大市场占有率的18种卷烟样品,自制3个添加烟碱样品。 国内烤烟:红塔山,红双喜,大红鹰,白沙,南洋双喜 ; 国外烤烟:555,Dunhill 括性炭复合滤嘴 ,Davidoff; 国内混合型:3mg 活性炭复合滤嘴 ,5mg 活性炭复合滤 嘴 ,10mg,七匹狼,都宝,中美,金鹿,嘉得乐: 国外混合型:KENT,hIARLBORO; 具体规格如表3所示。 表3卷烟样品具体规格 盒标焦油 盒标烟碱 烟支长度 滤嘴长度 接装纸长度 样品名称 生产厂家 mm mm mm mg mg 红塔山 红塔集团 15 1.2 84 24 28 红双喜 上海烟草集团 1l 1.o 84 20 24 大红鹰 宁波卷烟厂 15 1.3 84 20 29 白沙 长沙卷烟厂¨ 15 09 84 20 30 555 英美烟草集团 12 1.2 84 2l z5 Ihlnhill 3 伦敦登喜烟草公司 0.3 84 22 32 南洋双喜 南洋兄弟烟草 16 1 2 84 20 24 Dayidoff 13 0.9 93 25 29 利足美股份有限公司 3mg 卷烟厂 3 0.3 84 25 30 5ag 卷烟厂 5 0.5 84 25 30 10nlg 卷烟厂 10 1 0 83 20 25 七匹狼 龙岩卷烟厂 9 0.8 84 20 29 都宝 芜湖卷烟厂8 1 0 84 20 29 中美 武汉烟草集团 17 l 3 84 20 24 金鹿 上海烟草集团8 0.7 84 25 30 嘉得乐 韶关卷烟厂 15 1,1 84 20 24 Kent 布朗威廉森 13 0.9 83 21 2B Marlboro菲莫烟草集团 12 1.0 84 21 25 2.1.2试剂 2.1.3标样 生物碱标样:烟碱 Fluka公司 ,降烟碱、麦斯明、假木贼碱、可替宁 ALdrich 公司 。以上纯度 98% 内标:2一甲基喹啉、2,4’一二联吡啶 ACROS公司 。以上纯度 98% 2.1A仪器 感量天平 ldettler公司 HP6890GC~NPD Agilent公司 HP6890GC―HP5973MS Agilent公司 JJZ一20型自动抽烟机 无锡通辰科技公司 超声波振荡器 昆山市超声仪器有限公司 101A一1型干燥箱 宁波自动化仪表厂 SPME Varian公司 2.2实验方法 2.2.1实验样品准备 烟叶:将烟叶抽梗,在101A―l型干燥箱中恒温40。C干燥2小时,取出后用 粉碎机粉碎,过40目筛后置于密封带中待测,用烘箱法测定含水率。“。 卷烟:按照卷烟抽样标准“21将成品卷烟从盒包中取出,置于温度20±1℃、 相对湿度60±2%下平衡48h以上””,筛选重量和吸阻后使用JJZ一20型自动 抽烟机抽吸,捕集烟气后的剑桥滤片待测,捕集烟气后的滤嘴待测。 卷烟烟丝:将20一40支成品卷烟剥开,取烟丝,在烘箱中恒温40。C干燥2 小时,称重计算各牌号单支卷烟净烟丝平均重量,然后用粉碎机磨碎烟丝,过 40目筛,密封待测,用烘箱法测定含水率”“。 添加烟碱的“白沙”:抽取一定数量经抽样、平衡并筛选过重量和吸阻后的 p 白沙,分为3组,各用微量注射器注入100 l烟碱溶液,添加量分别为:4.512mg/ 支、7.520mg/支和15.040mg/支,再次平衡48h后抽吸。 2.2.2烟草中生物碱的测定方法的建立I删 2.2.2.1标样标准工作曲线 取准确量的标样,混合后采用逐步稀释法配制6个不同浓度的生物碱标准溶 液 表4 ,各生物碱标样加入混合内标后在GC―NPD上分析,根据各生物碱标样 和内标物在GC―NPD上的峰面积比以及各生物碱标样和内标物的浓度比,按公式 1 得到各生物碱内标标准工作曲线 生物碱标准溶液浓度梯度 蠢≮ 烟碱降烟碱 麦斯明 假木贼碱 可替宁 4.5120 0.1000 0.1740 0.1780 02340 i。 0.9024 00500 0.0870 0.0890 0.1170 2。 0.4512 0.0250 0.0435 00445 0.0585 3‘ 0.0902 0.0100 0.0174 00178 0.0234 4’ 0.045l 0.0050 0.0087 00089 0.0117 5‘ 00090 00025 00044 0.0045 0.0059 6‘ 丢 砖普………………………………… 1 其中:A。――各生物碱的峰面积,A,~一内标物的峰面积;M、一~各生物碱的 浓度,M,一内标物的浓度;K,――标准:【作曲线的斜率。 各生物碱的内标标准工作曲线可由Excel按照最小二乘法直接获得,由于系 统误差,各标准工作曲线并不严格通过原点,结果见图3和表5。 膺__碱一2.●一-咖睫标堆I%曲拽 4 薰a 謦z 【 1 o 。藉碱,内标浓度比‘ ‘ 2j年船碱岛标浓爰比 壹斯w―1.●一二群毗蛀标堆I作曲姥 髑术t睡~2―4一 联毗啶抒准I怍曲线 孽a 丑落衄警 i 2 l 0 2 麦新晶/内标浓叠比 o 2 假木碱矗/内杯浓蘑比 墨8 嫠 2 0 o 2 1可咎宁,6内标浓窿比 圈3各烟草生物碱内标标准工作曲线 袁s烟草中生物碱内标标准曲线可知,在所测范围内,各生物碱的标准曲线的线性相关性非常 好,适合于定量分析。 2.2.2.2样品前处理条件的确定 根据预备实验结果,确定了样品前处理条件和流程,如图4所示: 烟叶抽梗 40 2干燥2h 1ml 磨碎,k。。。炉一烘暮蒙擎 5% NaOH lOml含内 ∑出羽末 CHCk I 超倒振荡 15min l t 取清液过滤, 无水硫酸钠干燥 j 进GC.NPD 圈4生物碱涪剂前处理方法流程确定 2.2.2.3方法薰复性、回收率 取5组150mg烟叶样品,按照图4所示前处理步骤做重复性实验,结果见表 6,烟碱的变异系数小于1%,其它生物碱变异系数均在6%以内,考虑到除烟碱外 其它生物碱含量较少,均在微克级左右,故该实验前处理方法重复性较好,可用 于烟草生物碱定量分析。 襄6方法重复性 重复性实验烟碱%降烟碱%麦斯明*艘术城碱%新烟碱%可替宁% 4 4.33400.61570.0211 O.0747 0.54190.0150 5 4.32100.61350.0212 0.0719 0.53970.0142 0.59470.0205 0.07t6 0.52750.0142 平均值4.3198 -――――。^,_,-_,,―__--。__,__。_^。___“H。-‘_。“-。“。__-_-_-―J―_●-―-――-―,―●●―十__―。_。_。_-。‘‘●‘。“―。__。。。。_~。“。’。。‘‘●―‘。。’。‘‘一~ RSD%0.93542.16455.7359 2.2886 L39623.6706 取一定量的各生物碱标样加入到150mg烟叶样品中,再将其与150mg烟叶样 品进行平行前处理和Gc分析。连续做5次,得到各生物碱的测定值,并求取平 均值,计算其回收率,结果见表7。 表7前处理过程烟草生物碱回收率 生物碱mg烟样测定值 加入标样量 烟样+标样测定值 差值 回收率 99.31% 烟碱 7 4.8930 11.3386 4.8588 降烟碱 &m 0 0.3972 1.3005 0.4084102.83% 100.62% 麦斯明 8 0.0123 0.043l 0.0124 95.05% 假木贼碱 0.0593 0.1637 0.0564 新烟碱 结构、物性与假木贼碱相似, 回收率视为相同”…。 98.43% 可替宁 m吼群n 鳓嗍㈣㈣槲叫 3羊2 0.0780 0 0980 0.0768 2.2.2.4检测限和定量限 按照3倍信噪比计算方法检测限:DL;兰孚,按照10倍信噪比计算方 量限:DO.,lO.Nc。其中:DI.一检测限,DQ――定量限,N――基线噪音,c ――生物碱浓度,h――生物碱响应峰高。方法检测限和定量限结果见表8和表 9,其中表8是按照生物碱浓度给出,表9是按照换算的生物碱所占烟叶百分数 给出。 表8方法检测限 烟砒 降烟碱麦斯明假木贼碱新烟碱可替宁 2,2.2.5实验条件参数与优化过程 根据文献报道。8“ 平兀予日备实验情况,对不同溶剂、碱、碱浓度、加碱量以及 超声时间进行对比。初始条件定为:150mg烟样,iml 5%NaOH,lOml溶剂,20min 超声振荡。 溶剂的选择 选用二氯甲烷、三氯甲烷和二氯甲烷:甲醇 3:I 三种溶剂进行提取效率 比较,结果如表10: 表10溶剂提取结果对比 三种溶剂提取效率比较接近,其中三氯甲烷提取结果最接近表6中的重复性 平均结果,考虑到两个因素:①三氯甲烷的挥发性明显较其它两种溶剂低,可避 免超声振荡挥发引起的损失。其它两种溶剂均含有低沸点的二氯甲烷,而二氯甲 烷的挥发损失可能带来测定值偏高,同理也不再考虑前人采用的””和甲基丁 醚。”等挥发性较大的溶剂。三氯甲烷提取显然较其它溶剂更为稳定。②三氯甲烷 对含量较少的生物碱提取程度略占有优势。因此决定选取三氯甲烷作提取溶剂。 碱的选择 选用iml5%NaOH和Iml 5%氨水进行比较,结果如表1I: 表ll碱强度对比 文献报道的使生物碱游离化的方式有加强碱”。。”和加弱碱㈨两种,根据表l1 以及表6的重复性结果看:lml 5%的碱足以使给定样品量的生物碱完全游离,而 同浓度的氨水的提取效果稍稍差点,考虑到氨水很容易挥发,有可能影响到试验 5%NaOH。 测定的稳定性,最终决定选用lml 碱浓度的选择 选用1%、2%、5%和10%的NaOH进行比较,结果如表12 表12不同加碱浓度结果对比 对比表12结果可以发现,1%和2%碱浓度不利于生物碱的游离,尤其是烟碱、 麦斯明和可替宁似乎对碱强度稍稍:10%的碱加入后使得烟末发黑板结,也 不利于溶剂对生物碱的提取,这一点与YangS.S.等。”的实验结果很相似,而且 10%碱浓度的结果甚至还不如2%碱浓度的结果。选择5%碱浓度可以达到较好的提 取效果,既避免了碱浓度过低影响生物碱游离,也杜绝了可能的样品发黑板结现 象,同时在一定程度上保持了较好的方法强壮度“1。参照各浓度提取效率和表6 的结果,最终选定5%NaOH浓度。 加碱量的选择 选用0.3ml、lml、2ml以及3ml5%的NaOH进行比较,结果如表13 表13不同加碱量对比 从表13结果看,0.3ml的碱量结果略低于lml的碱量结果,所以0.3ml的碱 量肯定过少而不利于生物碱的游离:2ml的碱量结果和lml相似,并存在一定程 度的使待测样品发黑板结现象;3ml的结果总体比2ml还低,说明发黑板结现象 已经较为明显。根据变化趋势,加碱量只能在稍稍过量的一定范围内,不能过高。 参比表6的结果最终选定加碱量为lml。 超声时间的选择 表14不同超声耐f可结果对比 表14的结果表明超声提取5min效果较差,部分生物碱尚不足以被游离和提 取出来。在试验中发现:超声水浴温度随着超声时间延长而升高,这可能会导致 据提取效果的变化趋势,最终决定选择超声15min。 2.2.2.6溶剂超声提取和SPME比较 除传统的溶剂超声提取前处理方法外,还对顶空SPME和浸入SPME方法进行 了考察和对比,结果见表15。从表15的结果可以看出,两种SPME方法提取效 剂超声方法提取效果的气相色谱比较图

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